实时荧光定量PCR仪临床办理

实时荧光定量PCR（qPCR）仪在临床实验室中的应用涉及多个环节，包括样本采集、样本处理、实验准备、实验操作、结果判读和报告等。以下是对实时荧光定量PCR仪临床办理流程的详细阐述：

一、样本采集

1. 制定样本采集程序：应结合不同检测项目对样本的要求，并参考所使用试剂及耗材的说明，制定详细的样本采集程序。程序应包括采样时效、采样部位、样本类型、采样装置与采集容器、采集方法、采样量、质量评价注意事项等。

2. 样本类型：实时荧光PCR技术可检测的临床样本类型包括组织（新鲜组织、石蜡切片组织）、细胞及其培养产物、EDTA或枸橼酸抗凝全血、干血斑、血清、血浆、外周血单个核细胞、骨髓、其他体液（如脑脊液、浆膜腔积液、尿液、房水等）、产前诊断样本（绒毛膜、绒毛膜培养细胞、羊水、羊水培养细胞等）、拭子（采集分泌物、脱落细胞、微生物等）、分泌物（痰液、脓液、唾液等）、体腔与体表冲洗液（含脱落细胞、cfDNA）、粪便、含微生物的临床样本或微生物培养样本等。

3. 注意事项：

• 手术、输血、药物治疗等医疗行为可影响实时荧光PCR检测结果，采样前应明确患者有无接受上述诊疗行为，如有宜建议推迟采样或在报告中备注相关情况。

• 病原微生物检测采样时遵守无菌操作，避免样本被环境微生物和定植微生物污染。

• 全血和骨髓样本抗凝shouxuanEDTA与枸橼酸盐，不可使用肝素。

二、样本处理

1. 均质化：当细胞、菌体、病毒被裹挟或黏附在其它物质内时，可通过均质化使其释放。例如，痰液样本宜先消化释放菌体；粪便样本宜机械混匀；组织样本宜剪碎研磨。

2. FFPE组织处理：FFPE组织切片用于核酸提取前，应经过脱蜡、乙醇漂洗、风干、蛋白酶K消化处理。

三、实验准备

1. 试剂和设备：准备好所需的试剂和设备，包括PCR试剂盒、引物、模板DNA或RNA样品、荧光定量PCR仪等，并确保所有试剂和设备的质量良好。

2. 反应体系设计：根据实验需要，设计好PCR反应体系，包括引物浓度、模板DNA或RNA浓度、试剂盒成分等。合理的反应体系设计是保证实验成功的关键。

四、实验操作

1. 配样：按照实验需要对cDNA模板加水作适当稀释，涡旋混匀后离心。根据实际所检测样品和基因的数量计算加样体系，依次加入ddH2O、qPCRmix、引物，配成一管mix，涡旋混匀后再离心。准备适量的qPCR八连排板或96孔板，将混匀的mix按每孔一定量（如19μL）加入到八连排孔中。

2. 加模板：在每个孔各加入一定量的cDNA模板（如1μL）。加样完毕后，盖上八连排管盖，注意尽量从孔边上压紧管盖。涡旋混匀后离心，去除气泡。

3. 设置程序：在上机前设置程序，包括反应温度、孔板信息等。

4. 上机反应：将样品放入仪器中，开始反应。实验过程中，密切监控荧光信号的变化情况，确保实验顺利进行。

五、结果判读和报告

1. 结果判读：判读结果前应先查看样本扩增曲线形态，并根据项目SOP设定各荧光信号通道判读阈值。查看标准品、阳性质控品、阴性质控品的扩增曲线及Ct值是否正常，确保核酸提取的有效性。定性项目依据试剂盒声明的判断标准进行结果判读；定量检测项目根据分析测量范围下限和上限报告定量检测结果。

2. 结果报告：报告应至少包括受检者姓名和唯一标识、检测方法、报告项目中文和/或英文名称、计量单位、样本采集日期和时间、实验室接收样本的时间、报告发布日期和时间、检测者和报告者姓名和实验室信息等基本要素。

六、注意事项

1. 避免污染：在准备试剂和加样过程中，应注意避免污染和交叉污染。尽量使用一次性移液器枪头和吸头，不同实验的试剂应分开存放并标记清楚。

2. 移液器使用：移液器使用前应确保量程合适并校准准确。加样时应保持移液器垂直并缓慢吸取液体，避免产生气泡和误差。

3. 仪器保养：定期对仪器进行清洁、消毒、校准和检修，以确保其性能稳定可靠。

4. 实验环境：实验室应实行严格的分区管理制度，将试剂准备间、样本处理间、PCR室、电泳间等明确区分开来。实验人员应尽量减少在实验室内频繁走动，尤其是去过电泳间之后当天不可进入其他房间，以免带入污染物质影响实验结果。

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